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Abordagem inovadora aproxima a terapia de reprogramação celular para insuficiência cardíaca da realidade

Abordagem inovadora aproxima a terapia de reprogramação celular para insuficiência cardíaca da realidade

Megumi Mathison e equipe partiram do pressuposto de que a resistência de células maduras à reprogramação decorre de maiores controles epigenéticos sobre ativação de genes em espécies de ordem superior versus inferior para conduzir o estudo A transição de fibroblastos para um estado “trans” endotelial melhora a eficiência da reprogramação celular, publicado no periódico Scientific Reports. Megumi e a equipe destacam que a reprogramação de fibroblastos oferece o potencial de regeneração miocárdica via transdiferenciação celular in situ.

O estudo explorou estratégia que alavanca a plasticidade das células endoteliais para aumentar a eficiência da reprogramação. Células endoteliais cardíacas de ratos e fibroblastos foram tratados com Gata4, Mef2c e Tbx5 (GMT) para avaliar o potencial de cardiodiferenciação dessas células. O fator de transdiferenciação de células endoteliais ETV2 foi superexpresso transitoriamente em fibroblastos seguido de tratamento com GMT para avaliar a cardiodiferenciação “trans-endotelial”.

Megumi Mathison e a equipe observaram que células endoteliais tratadas com GMT geraram mais cTnT +células do que os fibroblastos cardíacos (13% ± 2% vs 4% ± 0,5%, p < 0,01). Os fibroblastos cardíacos tratados com ETV2 demonstraram aumento dos marcadores de células endoteliais e, quando tratados com GMT, produziram maior prevalência de células expressando marcadores de cardiomiócitos, incluindo cTnT, do que os fibroblastos tratados com GMT ou ETV2 (10,3% ± 0,2% vs 1,7% ± 0,06% e 0,6 ± 0,03, p < 0,01).

Além disso, fibroblastos cardíacos de ratos tratados com GMT + ETV2 demonstraram transientes de cálcio após estimulação elétrica e contratilidade síncrona com cardiomiócitos neonatais circundantes, enquanto células tratadas apenas com GMT ou ETV2 falharam em se contrair em experimentos de co-cultura. Fibroblastos cardíacos humanos tratados com ETV2 e depois GMT também demonstraram maior prevalência de expressão de cTnT do que células tratadas apenas com GMT (aumento de 2,8 vezes, p < 0,05).

O trabalho do grupo sugere que contra-estratégias “pró-plasticidade” que poderiam tornar as células-alvo mais suscetíveis à reprogramação podem representar uma abordagem útil para superar esse obstáculo, em oposição à estratégia comumente usada de adicionar maior número de fatores à reprogramação de coquetéis.

O artigo demonstra ainda que as características de pró-plasticidade da via EndMT de ocorrência natural podem ser aproveitadas para aumentar a reprogramação de fibroblastos cardíacos em um fenótipo de cardiomiócito induzido. Demonstramos que o pré-condicionamento de fibroblastos cardíacos com ETV2 antes do GMT aumentou a expressão do gene marcador de cardiomiócitos em comparação com células tratadas apenas com ETV2 ou GMT. É importante ressaltar que cerca de 3% das células tratadas com ETV2 + GMT demonstraram contratilidade quando co-cultivadas com cardiomiócitos neonatais, refletindo um nível de cardiodiferenciação funcional.

Megumi e a equipe ressaltam que a proposição da estratégia defendida pelo grupo, pró-plasticidade EndMT, é potencialmente prejudicada pela prevalência de fibroblastos, em vez de células endoteliais, como o principal constituinte do tecido cicatricial do miocárdio. Como tal, esse constituinte tem sido o alvo padrão das estratégias de regeneração miocárdica pós-infarto.

A demonstração do estudo, de que o fator de diferenciação de células endoteliais ETV2 pode ser usado para fazer a transição de fibroblastos para um estado de “célula trans-endotelial”, aborda esse desafio, tornando com sucesso um novo alvo para coquetéis de cardiodiferenciação padrão, como GMT. A observação da expressão de marcadores cardiomiócitos em fibroblastos tratados com ETV2, mesmo sem tratamento com GMT, sugere a potência da via EndMT na condução da cardiodiferenciação. A base teleológica para a predileção dessas células por tal cardiodiferenciação pode estar relacionada à primazia do tecido cardíaco como substrato da formação do primeiro órgão durante o desenvolvimento embriológico.

O estudo usou a estratégia de superexpressão de ETV2 transiente (indutível por Dox) para minimizar a persistência de influências de diferenciação de células endoteliais que poderiam ter atuado em oposição aos nossos tratamentos de cardiodiferenciação. Embora não tenha avaliado a expressão constitutiva de ETV2 para testar essa hipótese, aponta evidências anteriores de que a expressão sustentada de ETV2 previne a diferenciação de cardiomiócitos e leva a um fenótipo de células endoteliais sustentadas durante o desenvolvimento embriológico suporta a premissa de que um estado “trans-endotelial” induzido pela superexpressão transitória de ETV2 representa um alvo celular preferível para cardio-diferenciação.

Os estudos de imunofluorescência foram realizados após fixação de paraformaldeído a 4% e permeabilização das células com solução de Triton-X a 0,5%. As células foram então bloqueadas com soro de cabra a 10% e incubadas com anticorpos primários contra cTnT (diluição 1:300; Thermo Fisher Scientific), α-actinina (diluição 1:400; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e CD31 (1 :400 diluição, Abcam ab64543). O anti-rato de cabra Alexa 568 foi usado como anticorpo secundário (diluição 1:1000; Thermo Fisher Scientific). As imagens foram capturadas no microscópio Core Fluorescence e analisadas usando ImageJ. Para quantificar células positivas para marcadores, o número de células positivas para marcadores e células totais quantificadas marcadas por coloração DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) foram contadas em três imagens aleatórias (ampliação de 10 ×) selecionadas por um investigador cego ao grupo de tratamento.

Fonte

https://www.nature.com/articles/s41598-021-02056-x

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