Desde meados de dezembro do ano passado, a doença nomeada como novo CORONAVÍRUS de 2019 (COVID-19) vem se espalhando de Wuhan, na China, para todo Mundo.
Atualmente, o Ministério da Saúde confirmou 359 mortes por Covid-19 no Brasil, e 9.056 pessoas contaminadas até o momento, sendo que a taxa de letalidade apontada da doença no território brasileiro é de 4,0%.
O vírus SARS-CoV-2, como é reconhecido por provocar um quadro de síndrome respiratória aguda grave, é um vírus de RNA, cujo diagnóstico vem sendo confirmado por meio de 2 testes que empregam metodologias diferentes.
Diagnóstico rápido
Um teste imunológico rápido, lateral flow immunoassays (LFIA), ou point-of-care (POC) testing, que detecta anticorpos específicos, contra o COVID-19, em amostras de pacientes como sangue total, soro e plasma.
O sistema dispõe da metodologia imunocromatográfica, assim como nos testes para confirmação de Gravidez. O princípio do teste consiste em revelar a presença de anticorpos anti-IgM e anti-IgG direcionados para coronavírus, presentes na amostra dos pacientes. Esses anticorpos se ligam a conjugados presentes na placa que contém antígenos recombinantes do COVID-19.
Em casos positivos, esses anticorpos agregam-se nas regiões teste e formam uma linha colorida. Em casos negativos, é necessário que apareça apenas uma linha de controle, indicando assim a validade do resultado.
A maior vantagem está na simplicidade, não necessita de complexos laboratoriais, rapidez, possibilidade de ser transportado para regiões mais remotas e de difícil acesso e pode ser usado na busca ativa de caso ainda não confirmados.
Como desvantagens, obtém-se apenas resultados qualitativos (TEM OU NÃO TEM) e a aplicabilidade do teste ser possível apenas após o período de janela imunológica, período que compreende o dia no qual adquire-se a infecção até o início da formação dos anticorpos específicos contra o agente etiológico contraído. Tal feito pode prejudicar o controle da epidemia, impedindo que medidas de prevenção e precaução sejam tomadas previamente e AUMENTANDO a chance de contaminação de outras pessoas pela dissipação do vírus.
rRT-PCR
O rRT-PCR, um ensaio de base molecular, considerado o padrão ouro atual para comprovar infecção por COVID-19, requer um ensaio de PCR, aplicado em tempo real, associado à técnica de transcriptase reversa.
Mas calma, vamos por partes...
PCR significa Reação em Cadeia da Polimerase. A Polimerase é a enzima responsável por sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita existente. Por meio desse tipo de reação é possível amplificar exponencialmente fragmentos específicos de DNA, com a criação de milhões de cópias para serem analisadas.
No caso do COVID-19 as sequências analisadas são genes da fase de leitura aberta do SARS-CoV-2 1ab (ORF1ab), proteína de nucleocapsídeo (NP), proteína de membrana (M) e glicoproteína spike (S), essa é capaz de se ligar à receptores específicos de tecidos do nosso corpo, como ACE2, presentes nas narinas e boca, umas das justificativas para rápida propagação do agente.
Como o COVID-19 é um vírus de RNA, é necessário que a PCR seja precedida de uma reação de transcrição reversa (RT) para a obtenção de cDNA a partir de RNA viral, mediante ação da enzima transcriptase reversa, daí o nome RT-PCR.
O próximo passo é monitorar essa reação em tempo real, o rRT-PCR, do inglês Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, ou também chamado de RT-qPCR, Polymerase chain reaction quantitative real time, é a tecnologia que possibilita a detecção do material genético viral por meio da ligação de uma molécula capaz de emitir fluorescência aos produtos de PCR amplificados.
O aumento da fluorescência é o que proporciona tanto a detecção do patógeno quanto quantificação do produto final com precisão, sendo essa a grande vantagem desse método. Todo o processo leva em torno de 2-6 horas para ser concluído. Os ensaios que optam por analisar várias sequências alvos ao mesmo tempo são denominados RT-PCR multiplex e são os mais usados em laboratórios de primeira linha.
As amostras clínicas para esse experimento podem vir de lavagem broncoalveolar, escarro, esfregaços nasais, sangue e até das fezes. No Brasil, a amostra preferencial para o diagnóstico laboratorial é a secreção da nasofaringe. O diagnóstico laboratorial é feito por meio de técnicas de rRT-PCR optando por sequenciamento parcial ou total do genoma viral.
Alguns estudos recentes referem presença de resultados falso-negativos como principal desvantagem da rRT-PCR. Esses resultados falso-negativos seriam oriundos de erros pré-analíticos e de execução da técnica. Problemas como identificação do paciente, coleta inadequada, transporte e armazenamento ineficaz, além de problemas técnicos no equipamento e falta de pessoas especializadas, prejudicariam o desempenho do ensaio e a precisão do diagnóstico.
Além de que a técnica vem sendo descrita como “demorada” por conta do aumento na demanda de amostras para serem analisadas e poucos locais possuírem aparato necessário para conduzi-la, já que é necessário nível de Biossegurança 3.
Outros pontos importantes que têm sido levantados em relação à metodologia padrão são especulações à respeito de mutação viral ativa e a necessidade de associar os dados clínicos e exames de imagem aos resultados obtidos nos testes aqui descritos.
Vale ressaltar que apesar dos avanços relatados, só neste ano, à respeito do diagnóstico de Coronavírus, no cenário atual, as certezas andam numa linha tênue junto das incertezas. A cada momento novas medidas são implementadas, e novas verdades são postuladas. Cabe a nós, profissionais da saúde, nos mantermos atualizados e continuarmos na luta por novas descobertas e soluções, sem perder a esperança.
Esperança não é a convicção de que algo vai dar certo, mas a certeza de que algo tem significado, independentemente de seu resultado - Václav Havel
Referências
- Lippi, G., Simundic, A., Plebani, M. (2020). Potential preanalytical and analytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19), Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) (published online ahead of print), 20200285.
- Li, D. et al. (2020). False-Negative Results of Real-Time Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2: Role of Deep-Learning-Based CT Diagnosis and Insights from Two Cases. Korean J Radiol. Apr;21(4):505-508.
- Liu, R. et al (2020). Positive rate of RT-PCR detection of SARS-CoV-2 infection in 4880 cases from one hospital in Wuhan, China, from Jan to Feb 2020. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry, 505, 172–175.
- Fahmi, M., Kubota, Y., Ito, M. (2020) Nonstructural proteins NS7b and NS8 are likely to be phylogenetically associated with evolution of 2019-nCoV. Infect Genet Evol. Mar; 3;81:104272.
- Lu, R. et al. (2020) Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. Feb 22;395(10224):565-574.
- Sheridan, C.(2020). Fast, portable tests come online to curb coronavirus pandemic. Nat Biotechnol. Mar 23.
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Nota do editor: esse foi o sexto texto mais lido da comunidade Academia Médica no ano de 2020 e foi publicado no dia 04/04/2020.